Untersuchung von Lokalisation und Transportmechanismen
Wenn man bei der Sythese den zu untersuchenden Moleküls radioakive
Isotope, die in das Molekül eingebaut werden, so kann man dessen
Lokalisation nachweisen.
Bei einer Pulsmarkierung (Puls-chase-Experiment) wird eine kurze
radiaktive Markierung gesetzt und dann schon bald darauf wieder
ausgewaschen. So befindet sich nur ein geriniger Anteil radioaktiver
Substanz in der Zelle, deren Verteilung man gut sichtbar machen kann.
Die Ionenkonzentration einer Zelle kann man mit einer mit KCl
gefüllten Glaselektrode, die man in die Zelle einsticht,
messen. Ist die Spitze der Elektrode nur für ein Ion permeabel,
spricht man von einer Ionenselektiven Elektrode, die spezifisch das
Potential eines Ions misst.
Einzelne Membranabschnitte kann man untersuchen, indem man mit
einer Glaspipette den gewünschten Abschnitt ansaugt und dann entweder
gegen die Zelle ableitet oder das Membranstück herausreisst und
isoliert untersucht.
Bei eingen Ionen (vor allen Calcium) kann man dessen Konzentration
messen, indem man einen Indikator verwendet, der Calcium bindet und
dann bei einer anderen Wellenlänge flouresziert. Wenn man dann den
Quotienten der beiden Floureszenzen bildet, kann man die
Calciumkonzentration bestimmen.
Wenn der Indikator nicht von selbst in die Zelle eindiffundiert, kann
man ihn durch eine Mikroinjektion in die Zelle injizieren.
Mit dieser Methode kann man aber auch Antikörper oder
floureszenzmarkierte Proteine in die Zelle einbringen und deren
Verteilung über die Zeit beobachten.
Neben der Mikroinjektion kann man eine Substanz auch dadurch, dass man
die Zellmembran permeabel macht (Elektroporation) oder durch die
Verwendung von Membranvesikeln in eine Zelle einbrinden.
Für einige kleine Moleküle hat man auch Käfig-Moleküle synthetisiert,
die bei einer Anregung durch Licht zerfallen und ihren Inhalt (ATP,
Glucose, etc.) freisetzen.
Durch Antikörper kann man Proteine sehr exakt nachweisen.
Zumeist verwendet man neben dem primären Antikörper, der das gesuchte
Protein erkennt, einen sekundären Antikörper, der an dem primären
bindet, und dadurch, dass an ihn entweder ein Enzym, ein
floureszierender Farbstoff oder Goldkügelchen gebunden sind das Signal
verstärkt.
Normalerweise erstellt man Antikörper gegen ein Protein, indem man es
einem Tier injiziert und dessen Immunsystem die Antikörper
produziert. Um einheitliche, monoklonale Antikörper zu erhalten,
fusioniert man einige der B-Lymphozyten des Tieres mit B-Lymphozyten
aus einer Tumorzelllinie und erhält so Zellen, die identische
Antikörper produzieren.
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