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Untersuchung von Lokalisation und Inhalt Methoden Aufbau der Zelle

Unterabschnitte


Genetische Methoden


Restriktionsendonukleasen

Restriktionsendonukleasen werden von Bakterien als Schutz gegen viren gebildet. Sie wirken, indem sie die Viren-DNA zerschneiden.

Diese Enzyme schneiden eine DNA-Sequenz an einer bestimmten Stelle, die durch vier bis acht Basen definiert ist. Liegt diese Stelle im Bakteriengenom selbst vor, sind einige der Basen methyliert.

Einige Enzyme schneiden die DNA so, dass ein DNA-Strang überhängt. Diese Enden bezeichnet man als Klebeenden und man kann sie dazu verwenden, um mehrere DNA-Moleküle, die mit dem gleichen Enzym geschnitten sind, aneinander zu fügen. So erstellte DNA-Moleküle werden als rekombinierte DNA bezeichnet.

Wenn man ein DNA-Stück mit einer bestimmten Restriktionsendonuklease schneidet, erhält man einige in Anzahl und Länge charakteristische Fragmente. Bei Verwendung mehrerer Restriktionsenzyme kann man eine sogenannte Restriktionskarte einer bestimmten Region aufstellen, in der die einzelnen Schnittstellen verzeichnet sind. Durch solche Verfahren kann man Gene charakterisieren ohne deren Sequenz zu kennen.

Die so erhaltenen Moleküle lassen sich in einem Agarosegel in einem elektrischen Feld nach ihrer Grösse auftrennen.

Bei grösseren DNA-Fragmenten benutzt man die sogenannte Pulsfeld-Gelelektrophorese, bei der sich das Feld periodisch ändert und man so verhindert, dass sich die DNA-Moleküle in einer schlangenförmigen Konfiguration ausrichten. Da die langen Moleküle länger brauchen um sich im Feld auszurichten, wandern diese langsamer und man kann auf diese Weise ganze Chromosomen von Bakterien oder Hefen auftrennen.

Die Banden werden sichbar gemacht, indem man entweder ein radiaktives Nukleotid in die DNA einbaut oder indem man die Banden mit Etidiumbromid, einem im UV-Licht floureszierenden Farbstoff färbt.


Markieren von DNA

Man kann DNA auf unterschiedliche Arten markieren. Zum einen kann man die DNA aus radioaktiv markierten Nukleotiden herstellen oder die chemisch markieren. Diese Verfahren bieten sich an, um die DNA als Sonde zu verwenden. Für das DNA-Footprinting oder die Sequenzierung hängt man mittels der Polynucleotidase ein einzelnes ATP an die DNA.


DNA-Sequenzierung

Bei der Sequenzierung unterscheidet man eine chemische von einer enzymatischen Methode.

Bei der chemischen Methode verwendet man die oben genannten radioaktiv markierten Fragmente und behandelt sie in vier verschiednen Ansätzen mit einem Reagenz, dass jeweils bei einer der vier Basen den Strang zufällig spaltet.

Trägt man dann diese Fragmente auf einem Gel auf, so erhält man chakteristische Banden für jede Base. Dieses Gel kann man entgegen der Laufrichung lesen - dies ergibt die Basensequenz.

Bei der enzymatischen Methode wird die DNA mittels der Polymerase vervielfältigt. Dabei befindet sich neben den normalen den normalen Nukleotiden ein Überschuss an Didesoxy-Nukleodid einer Base in der Lösung. Diese kann zwar in die DNA eingebaut werden, allerdings können keine weiteren Nukleotide angehängt werden.

Dadurch entstehen wiederunm Fragmente einer charakteristischen Länge für jede Base. Diese Fragmente lassen sich in einem Gel kontrollieren.


DNA-Footprinting

Auch für das DNA-Footprinting wird die DNA am Ende radioaktiv markiert und durch zufällig Spaltung oder durch Restriktionsenzyme in Anwesenheit eines DNA-bindenden Proteins gespalten.

An der Stelle, an der das Protein an die DNA bindet kann keine Spaltung stattfinden. Dadurch entsteht durch Vergleich der Restriktionsmuster einer DNA mit und ohne Protein bei der Probe mit Protein eine leere Stelle auf dem Gel - ein ,,Fussabdruck``.


Hybridisierungstechniken

Hybridisierung bezeichnet das Aneinanderlagern von zwei komplementären DNA- oder RNA-Strängen.

Im einfachsten Fall verwendet man eine einzelsträngige DNA als radioaktiv oder chemisch markierte Sonde. Diese gibt man in eine Lösung mit einzelstängiger gespaltener DNA eines Chromosoms und verdaut nach kurzer Inkubationszeit alle Einzelstrang-DNA auf diese Weise kann man homologe Regionen isolieren.

Eine weitere Einsatzmöglichkeit der Hybridisierung ist die Analyse von Exonsequenzen. Hierzu hybridisiert man die klonierte DNA mit der dazugehörigen DNA. Durch einen anschliessenden Verdau mit einer S1-Nuklease, die die Einzelstränge abbaut, kann man die nicht hybridisierten Introns entfernen und die nach Denaturierung getrennten Exons im Gel analysieren.

Nortern und Southern Blot

Das Northern Blotting wird häufig dazu verwendet, um Unterschiede in einer RNA-Population zwischen einem normalen Tier und einer Mutante festzustellen.

Hierzu wird die RNA-Population eines bestimmten Gewebes oder zwei unterschiedlicher Mutanten aufgereinigt. Durch eine Gelelektrophorese werden die RNA-Moleküle aufgetrennt und anschliessend durch ein ansaugen mit einem Papierstapel auf einer Nitrozellulosemembran aufgebracht.

Diese Membran behandelt man dann mit einer markierten DNA-Sonde, die eine komlementäre Sequenz zu der gesuchten enthält. Diese Sonde kann man dann durch Autoradiographie nachweisen.

Beim Southern Blot analysiert man an Stelle einer RNA-Population eine DNA-Population.

Restriktionsfragmentlängenpolymorphismus (RFLP)

Bei sehr grossen Genomen kann man diese entweder physikalisch Kartieren, indem man die Nukleinsäuresequenz analysiert oder man fertigt eine genetische Kopplungskarte an.

Letztere orientieren sich an der Häufigkeit, mit der zwei Merkmale gemeinsam vererbt werden. Tritt ein Marker nur selten auf, so handelt es sich um eine Mutation, wenn er häufiger auftritt, ist es ein Polymorphismus.

Bei einem Restriktionslängenpolymorphismus werden bestimmte Sequenzen als Marker verwendet. Diese sind Schnittstellen von Restriktionsenzymen, was man nutzt, indem man das Chromosom mit einem Mix von Restriktionsenzymen behandelt und dann einen bestimmten Abschnitt mit einer Sonde im Southern Blot nachweist. Wenn sich das Muster der Restriktionsschnittstellen verändert hat, dann markiert die Sonde eine andere Bande.

Wenn zwei Marker auf unterschiedlichen Chromosomen liegen, ist die Wahrscheinlichkeit, dass diese gemeinsam vererbt werden relativ gering. Man nennt diese Gene ungekoppelt im Gegensatz zu Genen, die auf einem Chromosom gekoppelt liegen und nur durch Crossing-over getrennt werden können.

In situ-Hybridisierungstechniken

Bei der in situ - Hybridisierung verwendet man eine DNA-Sonde, um in der Zelle eine DNA oder RNA zu lokalisieren. Dabei markiert man die DNA so, dass die hinterher mit einem Antikörper in der Zelle nachgewiesen und somit lokalisiert werden kann.


Klonierung

Bei der Klonierung wird ein DNA-Fragment durch einbringen in einen Prokaryoten - meist E. coli - vermehrt.

Plasmidvektoren, die zum Klonieren von Genen verwendet werden, sind kleine ringförmige DNA-Moleküle. Man kann diese mit einem Restriktionsenzym aufschneiden und eine DNA-Sequenz einbringen, die nach der Transformation in ein geeignetes Bakterium von diesem repliziert wird.

DNA-Bibliotheken

Um eine DNA-Bibliothek herzustellen schneidet man das gesamte Genom mit einem bestimmten Restriktionsenzym und stellt davon Plasmide her. Diese bilden einen genomischen DNA-Klon, der mit den anderen zusammen die genomische Bibliothek bildet.

Bei einer cDNA-Bibliothek verwendet man an Stelle der genomischen DNA die zur RNA komplementäre cDNA, so dass man eine Bibliothek von codierenden Sequenzen erhält. Die cDNA stellt man her, indem man die RNA mit der Reversen Transkriptase der Retroviren in DNA umschreibt und diese in Plasmid- oder Virusvektoren einbringt.

Durch subtraktive Hybridisierung kann man selektiv bestimmte cDNA-Klone anreichern, die in einer Zelle vorkommen, in einer anderen hingegen nicht (vor allem bei Mutationen oder Unterschieden zwischen Zellen). Hierzu gibt man die mRNA der Zelle, die das gesuchte Protein nicht exprimiert zu einer cDNA-Bibliothek einer Zellform, die das gesuchte Gen exprimiert. Durch Fällen der RNA-/DNA-Hybride erhält man eine aufgereinigte Form der gesuchten cDNA.

Um ein Gen aus einer Bank von transfizierten zellen zu erhalten, bildet man zunächst einen Abklatsch der Kolonien auf einem Filterpapier und schliesst die dort befindlichen Zellen auf. Dann kann man mit einer Sonde die Kolonien, die das gesuchte Gen enthalten nachweisen. Die dazugehörige Kolonie wird dannvermehrt.

Wird nicht das Gen, sonder das Protein gesucht, kann man sich Expressionsvektoren herstellen, die in den Bakterien das Protein produzieren. Dieses kann man dann nach der oben genannten Methode mit Antikörpern als Sonde detektieren.

Die aus einer Bibliothek gewonnene DNA überprüft man, indem man in vitro das Protein synthetiert und dieses nachweist.

Chromosome Walking

Geht man von einer gentischen Kopplung von Genen aus, so dann man den Ort eines Gens auf einer Kopplungskarte, wie oben beschrieben lokalisieren.

Bei der eigentlichen Chromosomenwanderung geht man von einer bekannten Markierung aus und stellt aus diesem Bereich eine Sonde her, mit der man einen Klon aus einer Bibliothek fischt, der diese Sonde enthält. Aus dem Randbereich dieses Abschnitts leitet man sich eine weitere Sonde ab, mit der man nach dem nächsten Abschnitt fischt. So kann man ein Chromosom in Teilabschnitte von ca. 30.000 Basenpaaren einteilen.

Die gewonnenen Abschnitte kann man dann zum Beispiel in das Chromosom einer Mutante integrieren und auf ihre Funktionalität hin prüfen. Diese Abschnitte können dann in lambda-Phagen (Cosmide) eingebracht und kloniert werden. So erhält man eine geordnete genomische Bibliothek. Noch längere Fragmente können in den YAC's dargestellt werden.

Positionelle Klonierung

Mit der positionellen Klonierung hat man ein Verfahren entwickelt, das es erlaubt, jedes beliebige Gen, das für eine Krankheit verantwortlich ist, zu isolieren. Der gesamte Prozess benötigt allerdings 10 bis 100 Mannjahre zur Lokalisierung eines einzelnen Gens.

Die Methode beginnt mit einem Stück der genomischen DNA, die sich zwischen zwei RFLP-Markern befindet, die mit dem Merkmal zusammen vererbt werden. Von diesem Bereich wird eine geordnete genomische Bibliothek erstellt, in der dann die in der Maus konsverierten Sequenzen durch Hybridisierung festgestellt werden. Die entsprechenden Sequenzen werden dann daraufhin untersucht, ob sie für eine bestimmte DNA in dem Zielgewebe codieren. Unter den Sequenzen für die dies der Fall ist, wird dann diese ausgewählt, die bei den Personen mit einem mutanten Phänotyp von den anderen abweicht.


Polymerase-Kettenreaktion (PCR)

Mit der PCR ist es möglich, ein bestimmtes Fragment in beliebiger Häufigkeit zu amplifizieren.

Dabei geht man so vor, dass eine Doppelstrang-DNA zuerst durch erhitzen getrennt wird, dann hat man spezifische Primer zugegeben, die an den Enden der Sequenz binden. An diesen Primern kann dann eine Polymerase angreifen (meist aus einem thermophilen Bakterium Thermus aquaticus - Taq), die dann die Einzelstränge zu Doppelsträngen ergänzt. Diese werden dann im nächsten Schritt wieder aufgetrennt und der Zyklus beginnt von vorne.

Auf diese weise amplifiziert man eine DNA exponentiell. Dadurch kann man auch winzige Mengen DNA (oder RNA durch Verwendung der Reversen Transkriptase) amplifizieren und nachweisen. So kann man Erbkrankheiten nachweisen oder in der Kriminalistik einen genetischen Fingerabruck erstellen.


DNA-Manipulation

Durch die PCR ist es möglich, bestimmte DNA-Abschnitte gezielt zu vervielfältigen und die Enden so zu modifizieren, dass man die Sequenz in einen Vektor einbringen kann.

Durch in vitro-Transkription kann man auf relativ einfache Art und Weise aus einer DNA grosse Mengen RNA herstellen.

Bringt man die Information eines Proteins in einem Exptrssionsvektor under, so kann man diese in beliebieger Menge in einem Bakterium synthetisieren.

Die Transkription eines Gens wird von regulatorischen Einheiten der DNA kontrolliert. Diese lassen sich mit Reportergenen untersuchen. Bei einem solchen Verfahren wird die Information des eigentliche Proteins durch die Sequenz eines anderen leicht nachweisbaren Proteins ersetzt. Die Expression eines solchen Gen, wie zum Beispiel der $\beta$-Galactosidase kann dann durch eine Farbreaktion zeitlich wie räumlich festgestellt werden.


Mutante Organsimen

Die Funktion eines bestimmten Proteins kann man am besten bei Mutanten untersuchen. Die Mutanten, die ein Protein nicht bilden könnnen zeigen normalerweise durch die Defekte seht gut, welche Funktionen das Protein normalerweise erfüllt.

Gerade bei Tieren mit kurzen Vermehrungszyklen kann man deren DNA durch Mutagene gezielt zu Mutationen anregen. Dann sortiert man gezielt die interessanten Mutanten aus.

Bei menschlichen Zellen kann man vor allem mit Zellkulturen arbeiten. hier arbeitet man vor allem mit genetischen Methoden, mittels derer man gezielt Mutanten eines bestimmten Gens hervorruft. Bringt man mutierte Gene in eine fremde Zelle ein, so spricht man von Reverser Genetik. Dieses Verfahren führt, wenn die Zielzelle eine Eizelle ist, zu einem transgenen Organismus.

Um die Funktion eines Proteins genauer zu untersuchen, stellt man entweder über die PCR gezielte Mutationen her (über einen Primer eingeführt) oder man stellt Fusionsproteine her, die die Lokalisationssequenz des zu untersuchenden Proteins, fusioniert mit einem Reportergen enthält, welches man dann in der Zelle leicht nachweisen kann. Ist dies nicht möglich, kann man auch die Technik der Epitopmarkierung verwenden, bei der an das eigentliche Protein nur ein kurzes Peptid von einigen Aminosäuren angebracht wird, welches man dann mit einem Antikörper nachweisen kann.

Bei vielen niederen Eukaryonten und Prokaryonten kann man ein Gen einfach dadurch ersetzen, indem man das mutierte Gen in die Zelle einführt und das dort das intakte Gen durch gene replacement mittels homologe Rekombination ersetzt.

Bei höheren, diploiden Organismen führt das Einführen einer mutierten DNA dazu, dass diese zusätzlich in das Genom integriert wird. Bringt man zusätzlich antisens-RNA gegen die ursprüngliche RNA in die Zelle ein, so kann man die Translation des gesungen Proteins verhindern.

Ist das Protein für die Zelle lethal, so kann man es mit einer Kontrollsequenz verbinden, die es erlaubt, das Gen gezielt zu aktivieren (induzierbar).

Obwohl sich die fremde DNA normalerweise beliebig in das Genom der Säuger integriert, kann sie in einem unter 1.000 Fällen das homologe Gen ersetzen.

Für dieses Verfahren wird das mutierte Gen in einen Vektor integriert und in embryonale Stammzellen (ES-Zellen) der Maus eingebracht. Diese Zellen lässt man dann in Kultur wachsen und selektiert die Zellen, in denen das Gen ersetzt wurde, indem man einen weiteren Marker auf dem Vektor anbringt, der in den Zellen eine Sensitivität gegen eine bestimmte Substanz einbringt. Dieser Marker wird bei einer homologen Rekombination nicht miteingebaut - wohl aber bei einer willkürlichen Integration.

Diese Stammzellen bringt man dann in einen Embryo ein. Ein grosser Teil der Zellen des Embryos werden dann von der mutierten Zelle abstammen. Wenn man Glück hat, dann sind dabei auch Zellen der Keimbahn betroffen und man kann durch Züchtung eine homozygote Knock-out-Maus erzeugen.

Bei Pflanzen lassen sich auf einzelnen Zellen auf geeignetem Nährmedium Kallusgewebe züchten, welches man dann teilen und zur Produktion vieler identischer Pflanzen nutzen kann.


 
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