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Verlauf der Translation

Inhalt

Transkription und Translation

Spleissen der RNA

Unterabschnitte

Transkription

Die RNA-Polymerase entwindet an ihrem Vorderende die DNA und lässt so im Inneren die Bildung von DNA-RNA-Hybriden zu. Die Ausdehnung dieser Transkriptionsblase beträgt ca. 12 bis 20 Basenpaare. Die Stelle, an der die RNA mit der DNa hybridisiert ist auf eine Länge von 3 bp beschänkt. Die meisten RNA-Polymerasen haben an ihrere Oberfläche eine Furche, in der die DNA zu liegen kommt.

Die RNA-Polymerase kontrolliert das passgenaue Binden des nächsten Nukleotids. Sehr wahrscheinlich werden die falschen Nukleotide von der Polymerase von der Bindung abgehalten.

Die Bewegung der RNA-Polymerase ist in einigen Bereichen gleichförmig und in anderen hingegen ruckartig. Wird sie in ihrer Synthese angehalten (weil z.B. ein Nukleotid fehlt), spaltet sie unter Katalyse von zwei Faktoren GreA und GreB das soebensynthetisierte 3'Ende der RNA ab und bewegt sich ein Stück weit an der RNA zurück, um die Synthese neu zu beginnen.

Die Transkription lässt sich in mehrere Phasen einteilen:

Bie Erkennung der Matrize durch die RNA-Polymerase bildet den ersten Schritt, durch den die Transkriptionsblase entsteht. Darauf folgt die Initiation, in der die ersten Nukleotide binden. Diese Phase ist dann beendet, wenn sich die Polymerase vom Promotor entfernt hat und geht dann in die Elongation über. Bei diesem Prozess wandert die Blase und verlängert das Transkript, bis eine Terminator-DNA-Sequenz erreicht ist und die Termination stattfindet.

Per Definition ist die RNA-Polymerase die kleinste Einheit des Tranksriptionskomplexes, die noch in der Lage ist, selbstständig RNA zu synthetisieren.

Die am besten charakterisierte Polmerase ist die von E. coli. Diese Polymerase ist ein Holoenzym, das sich aus mehreren Untereinheiten aufbaut:

Die $\beta$ -und die $\beta$ '-Untereinheit bilden das katalytische Zentrum. Zwei $\alpha$ -Untereinheiten kontrollieren den Zusammenbau des Kernkomplexes der Polymerase. Die $\sigma$ -Untereinheit schliesslich ist dafür verantwortlich, dass die Polymerase einen spezifischen Promotor erkennt. Dieser Komplexe Aufbau beruht darauf, dass das Enzym in der Lage sein muss, mit anderen Faktoren, die die Transkription regulieren, zu interagieren.

Der $\sigma$ -Faktor wird freigesetzt, sobald die RNA acht bis neuen Basen lang ist. Dadurch veränder sich die Form der RNA-Polymerase. Sie wird kürzer und bedeckt einen kleineren DNA-Abschnitt. Dadurch geht sie von der Initiation in die Elongation über. Der Sigma-Faktor gewährleistet, dass die RNA-Polyermase nur an den Promotoren stabil bindet. Das restliche ,,Core``-Enzym ist nicht spezifisch in seiner Bindung, sonden wird allein durch den $\sigma$ -Faktor gesteuert.

Das Auffinden der Bindungsstellen durch die Polymerase erfolgt im Allgemeinen zu schnell, als dass es auf einer einfachen Diffusion beruhen kann. Eine Theroe besagt, dass die Polymerase nach ihrer Bindung an das Genom die gebundene Sequenz so lange austauscht, bis ein Promotor erreicht ist. Eine alternative Theorie postuliert eine Bewegung der Polymerase entlang der DNA, bis sie eine Bindungsstelle erreicht. Die Bindung des Core-Enzyms an die DNA ist in Abwesenheit des Sigma-Faktors immer nur eine lockere Verbindung.

Der Sigma-Faktor bindet spezifisch an die Promotoren. Dies sind Sequenzen, die von Proteinen erkannt werden. Die Grösse dieser Strukturen nimmt mit der Grösse des Genoms zu, da immer ausgeschlossen werden muss, dass sich die Promotor-Sequenz an einer anderen Stelle zufällig im Genom befindet.

Bei E. coli scheint die genaue Sequenz eines Promotors nicht wichtig zu sein. Einige, in den meisten Promotoren hochkonservierte, Sequenzen bezeichnet man als Consensussequenzen. Man findet Consensussequenzen am Beginn des Promotors (häufig CAT), in der Region von -10 bp (meist TATAAT) und eine weitere konservierte Sequenz bei -35 bp (meist TTGACA).

Eine Mutation kann einen Promotor abschwächen (down-Mutation) oder dessen Funktion verstärken (up-Mutation). Häufig aber nicht immer ist eine up-Mutation dadurch gekennzeichnet, dass sich die Sequenz in ihrer Hologie näher an die Sequenz der Consensussequenzen annähert. Normalerweise quantifiziert man die Mutation durch einen Bindungstest der Polymerase in vitro.

Die Bindung der Polymerase kann durch das sogenannte Footprinting charakterisiert werden. Bei diesem Verfahren wird die DNA mit einer Endonuklease partiell abgebaut. Der Bereich, in dem die Polymerase gebunden hat, ist vor dem Aufbrechen der Phosphodiesterverbindungen geschützt. Isoliert man dann die geschnittenen Stücke, welche an ihrem Ende radioaktiv markiert sind, erhält man ein dichtes Muster von Banden, bei denen nur die Stelle, an die Polymerase gebunden hatte, leer bleibt und einen ,,Fussabdrck`` aufweist.

Durch eine (negative) Überspiralisierung wird die Transkription gefördert. Das Zwillingsdomänenmodell besagt, dass die RNA-Polymerase vor sich in der DNA eine positive Überspiralisierung erzeugt, während es hinter sich eine negative Überspiralisierung zurücklässt. Um diese Veränderungen auszugleichen werden die Enzyme Topoisomerase, die die DNA entspannt und Gyrase, die eine Spannung einführt, benötigt.

Die Initiation kann durch unterschiedliche Sigma-Faktoren kontrolliert werden. Die Sigma-Faktoren werden vor allem dann ausgetauscht, wenn die Transkription sich von Grund auf verändert. Grund für eine solche Umorganisation kann ein z.B, ein Hitzeschock sein. Bei einem Temperaturanstieg verändert sich die Zusammensetzung der $\sigma$ -Faktoren und führt dazu, dass andere Proteine hergestellt werden.

Durch Unterschiede in den Konsensussequenzen kann durch unterschiedliche $\sigma$ -Faktoren ein unterschiedliches Genset ein- oder ausgeschaltet werden. Die Sigma-Faktoren nehmen mit der Sequenz im Bereich -35 und -10 Kontakt auf.

Neben dem Hitzschock können auch andere Umwelteinflüsse wie eine Infektion durch einen Phagen oder der Eintritt in die Sporulation die Zusammensetzung der $\sigma$ -Faktoren in der Zelle verändern.

Bei einer Phageninfektion werden die frühen Gene des Phagen von der Polymerase des Wirtes umgesetzt. Unter den so umgesetzten Genen befindet sich auch ein neuer Sigma-Faktor, der den bakteriellen Faktor ersetzt. Die dadurch umgesetzen mittleren Gene sind dafür verantwortlich, dass die Polymerase nach ihrer Bindung nur noch die späten Gene umsetzen kann.

Bei der Sporulation ist der Nahrungsmangel ein entscheidender auslösender Faktor. Dadurch führt die Mutterzelle eine Mitose durch und kapselt eine Tocherzelle als Spore ab, während die andere Zelle lysiert wird. In der sporulierenden Zell werden unterschidliche Polymerase-Arten aktiv. Sie enthalten das gleiche Core-Enzym, allerdings einen anderen $\sigma$ -Faktor. Dieser wird durch die Kontrolle von phosphorylierten Sporulationsfaktoren von dem normalen $\sigma$ -Faktor synthetisiert.

Termination bei Prokaryonten

Die Transkription wird an einer bestimmte Terminationssequenz beendet. An einigen Termination können Antiterminatoren durch Bindung und Interaktion mit der Polymerase die Termination verhindern, was zu einem Überlesen der Stelle führt. Die Termination ist von dern bereits transkribierten - nicht aber von den noch zu transkribierenden Abschnitten abhängig.

An einigen Stellen kann dasn Core-Enzym in vitro die Transkription ohne die Hilfe von anderen Faktoren beenden. Diese Stellen werden intrinsische Terminatoren genannt. Im Gegensatz dazu wird die Transkription an den Rho-abhängigen Terminatoren nur in Anwensenheit eines Rho-Faktors beendet.

Die intrinsischen Terminatoren bilden eine auf eine UUUU-Sequenz folgende Haarnadelstruktur aus, die sehr wahrscheinlich die Polymerase zu einer relativ langen Pause veranlasst, so dass diese dann terminiert. Wenn sie Polymerase anhält, kann sich die PolyAU-Sequenz lösen, da die Bindung zwischen A und U relativ schwach ist.

Der Faktor Rho ist nur an der Termination der Transkription beteiligt. Dieser Faktor bindet an die RNA und ,,verfolgt`` die RNA-Polymerase auf dem Strang. Wenn die Polymerase an einer Terminationssequenz anhält, dann erreicht Rho die Polymerase und verursacht unter ATP-Hydrolyse die Trennung des RNA-DNA-Hybrids und beendet so die Transkription.

Normalerweise verhinder die Translation und die Bindung der Ribosomen die Aktivität von Rho. Bei einem als Polarität bezeichneten Phänomen verhindert eine Mutation in einem Gen die Transkription weiterer Gene innerhalb der Transkriptionseinheit. Die könnte darin begründet sein, dass sich das Ribosom durch die Mutation ablöst und Rho so in der Lage ist, die Transkription vorzeitig zu beenden.

Bei einigen Phagen und auch in Regelkreisen von Bakterien ist die Antitermination ein wichtiger Faktor. Bei den Phagen befindet sich zwischen den frühen und den späten Genen eine Terminatinossequenz. Nach der Aktivierung der frühen Gene werden Faktoren produziert, die eine Antitermination an dieser Stelle bewirken. Das Antiterminationsprotein gestattet es der Polymerase, die Terminationssequenz zu überlesen.

Die Faktoren binden vermutlich dann an die RNA-Polymerase, wenn sie eine bestimmte Sequenz, die nut-Sequenz erreicht. Dieser Faktor (pN) bindet an das Core-Enzym ähnlich dem Sigma-Faktor und verhindert, dass die Polymerase an einer Terminationssequenz stoppt. So kann diese nicht von Rho eingeholt werden. Ein anderer Faktor pQ wirkt auch eine andere Weise, indem er die Polymerase so modifiziert, dass sie an keinem Terminator mehr hält.

Das Operon

Ein Gen, das die Transkription eines anderen Gens kontrolliert wird Regulatorgen; das kontrollierte Gen wird Strukturgen genannt.

Ein Repressorprotein, das die Transkription eines Gens verhindert, bindet an dem in der Nähe des Promotors liegenden Operator und hindert so die Polmerase an einer Bindung an die DNA.

Als klassisches Beispiel für das Operon-Modell gelten die Strukturgene lacZYA, die der Zelle die Aufnahme und den Abbau von Laktose ermöglichen. Die Einheit aus diesen Struktur- und ihren Regulationgenen wird als Operon bezeichnet. Die Gene werden durch negative Regulation kontrolliert, d.h. sie werden transkribiert, bis das Regulatorprotein sie abschaltet.

Das Vorhandensein von Laktose induziert eine Transkription der entsprechenden Gene. Im umgekehtre Fall, wenn das Produkt eines Gens dessen Synthese hemmt, dann spricht man von Repression. Der Co-Repressor oder der Induktor wirkt über eine entsprechendes Protein auf die DNA ein. Die Bindung an dem Protein (dem Repressor) bewirkt über eine allosterische Kontolle dessen Bindung, was zu einer koordinierten Regulation der Synthese führt.

Wenn der Repressor den Induktor nicht binden kann, ist dies eine dem Wildtyp gegenüber dominante Mutation, die den Repressor fest mit der DNA verbindet. Diese Mutation wird auch als dominant-negativ bezeichnet, da die ,,schlechten`` Untereinheiten der Mutatante auch an dem anderen Allel eine Induktion verhindern.

Der Operator, die Erkennungsstelle des Repressors ist ein Palindrom und spiegelt den symmetrischen Aufbau des Proteins wieder. Die Wirkung des Induktors wird durch unterschiedliche Theorien zu erklären versucht. Nach einer Theorie befindet sich der Repressor in einem Gleichgewicht zwischen DNA-gebundener und freier Form, das durch die Bindung des Induktors zu Gunsten der freien Form verschoben wird. In einem anderen Modell ist der Repressor fest an die DNA gebunden und löst sich erst durch die Bindung des Indukors. Richtig ist sehr wahrscheinlich das letztere Modell.

Der Repressor bindet die DNA über ein Helix-Turn-Helix-Motiv. Dieses Motiv bildet zusammen mit einerm Schanier als Verbindung zum Kernprotein das Kopfstück des Proteins. Wenn der Induktor an das Kernstück bindet, verändert sich dessen Konformation so, dass die beiden Köpfe des Repressor-Dimers auseinander bewegen und die Bindung an die DNA verloren geht.

Für eine vollständige Repression ist das gleichzeitige Binden von zwei zu einem Tetramer vereinigten Dimeren an zwei aufeinanderfolgenden Operatoten notwendig. So kann die Transkription stufenweise geregelt werden.

Der Repressor verstärkt die Bindung der Polymerase und hinder sie so daran, einen Initiationskomplex auszuformen. So kann nach dem Binden des Induktors die Polymerase direkt mit der Transkription beginnen.

Man kann über Messungen an in vitro Systemen eine Gleichgewichtskonstate für die Bindung und Dissoziation des Repressors erstellen. Man kann daraus errechenen, dass 0,01% aller Repressorproteine in einer ungebundenen Form vorliegen. Die Fähigkeit eines Proteins seine Zielstelle zu binden ist von der Grösse des Genoms, der Spezifität des Proteins, der Proteinmenge und der Relation zwischen Anzahl der Proteine und Anzahl der Bindungsstellen ab. Wenn der Induktor bindet, sinkt die Affinität des Repressors zur DNA und er löst sich leichter. Er bindet dann - wie die nicht an den Operator gebundenen Repressoren es im Normalfall tun - an eine beliebige DNA-Sequenz mit niedriger Affinität.

Das Auffinden des Operators geschieht sehr wahrscheinlich nach der gleichen Methode, wie auch die Polmerase ihre Sequenz findet: der Repressor bindet unspezifisch und bewegt sich dann an der DNA entlang bis er den Operator findet. Im Normalzustand ist das Niveau des Respressors so geregelt, dass noch einige Gene abgelesen werden können; allerdings bedeutet dies auch, dass bei Vorhandensein des Induktors keine Bindung des Repressors erfolgt. Bei einer höheren Konzentration würde der Repressor auch bei vorhandenem Induktor noch einen grossen Anteil der Operatoren binden.

Im Gegensatz zum lac-Repressore kontrollieren einige andere Repressoren mehrere vertreut liegende Gene gleichzeitig. Dazu muss jeder Wirkort die gleiche DNA-Bindungssequenz aufweisen.

Grundsätzlich kann man bei einem Operon-Modell zwischen einer negativen Kontolle, bei der die Gene exprimiert werden, wenn sie nicht durch einen Repressor abgeschaltet werden und einer positiven Kontrolle, bei der es eines Aktivators bedarf, damit die Gene transkribiert werden. Auch der Austausch eines Sigma-Faktors ist eine positve Kontrolle.

In Abhängigkeit von einer niedermolekularen Substanz unterscheidet man induzierbare Operons, die in Anwesenheit der Substanz aktiv und reprimierbare sind nur bei Abwesenheit der Substanz aktiv. Beides kann über positive und negative Kontrolle erreicht werden.

Eine Art der postiven Regulation findet man an Promotoren, an denen die Polymerase nur in Anwesenheit eines weiteren Faktors binden und die Transkription starten kann.

Eine solche Regulation findet man bei dem Mechanismus der Katabolitrepression, bei der die Expression mehrere Operons für Lactose, Galactose, etc. zu Gunsten der Glukose verhindert wird.

Glukose reduziert dazu die Konzentration von cAMP in der Zelle. cAMP bindet normalerweise an ein CAP-Protein, das für die Transkription mehrerer Gene erforderlich ist. Durch ein Absinken des cAMP-Spiegels kann CAP nicht mehr binden und die Polymerase kann die Transkription nicht mehr initiieren.

CAP wirkt, indem die von ihm kontrollierten Polymerasen eine schlechte Bindung an die -10 und die -35 - Sequenz haben. Die CAP interagiert mit der Polymerase und der DNA und bewirkt so, dass eine Bindung zu stande kommt. Man vermutet, dass CAP an der gleichen Seite wie die Polymerase bindet und mit deren $\alpha$ -Einheit interagiert.

Wenn ein Bakterium nicht genügend Nährstoffe zum Wachstum vorfindet, stellt es einen grossen Teil seiner normalen Aktivität ein. Dies bezeichnet man als stringente Kontrolle. Die Synthese der rRNA und der tRNA wird verringert und senkt dadurch die gesamte RNA-Synthese auf fünf bis zehn Prozent.

Durch die stringente Kontrolle häufen sich zwei ungewöhnliche Nucleotide an: ppGpp und pppGpp sind Guaninphosphaten, bei denen sowohl die 5'- als auch die 3'-Postition mit Phosphaten versehen ist. Diese Nukleotide kontrollieren eine grosse Zahl an Zellaktivitäten und senkt die Vermehrungsgeschwindigkeit.

Der ganze Mechanismus wird dadurch, dass eine unbeladene tRNA an der Bindungsstelle des Chromosoms bindet aktiviert. Dies löst eine Leelaufreaktion aus, welche über den Stringenzfaktor die Konzentration der (p)ppGpp kontrolliert. Die eigentliche Synthese geschieht direkt an den Ribosomen. Die Synthese geschieht dadurch, dass der Stringenzfaktor RelA eine Phosphatgruppe vom ATP auf das Guaninnukleotid überträgt. Sobald sich die Gegebenheiten wieder normalisieren, wird das (p)ppGpp wieder abgebaut.

Translationskontrolle

Neben der Kontrolle der Transkrition kann ein Operon auch die Translation kontrollieren wenn es für Bestandteile des Proteinsyntheseapparates codiert.

Dabei wirkt ein Protein als Repressor, das an der mRNA in der Erkennungsregion bindet und so die Aktivität der Ribosomen verhindert.

Ein anderer Mechanismus besteht darin, dass das zweite Cistron so lange blockiert ist, bis diese Blockade durch das Genprodukt des ersten Cistrons aufgelöst wurde.

Diese Kontrollmechanismen gewährleisten, dass die Proteine immer in dem Ausmass synthetisiert werden, wie es die Umweltbedingungen erlauben.

Von einer autogenen Regulation spricht man, wenn ein Protein seine eigene Synthese (in dem Fall durch Regulation der Transkription) regelt. Diesen Mechanismus findet man bei Histonen und den Proteinen der ribosomalen Untereinheiten. Die Voraussetzung ist, dass das Protein eine Bindungsstelle für seine DNA-Sequenz besitzt. Bei den ribosomalen Proteinen ist die z.B. von der Konzentration der rRNA abhängig. Wenn diese in einer ausreichend hohen Konzentration vorliegt, dann binden die Proteine an die rRNA; wenn deren Konzentration unter ein kritisches Limit fällt, verhindern sie ihere eigene Translation.

Dieser Mechanismus ist weit verbreitet und bei einem mutierten Gen häufig defekt. Bei einem System, das sich selbst begrenzt, spricht man von einer intrinsischen Kontrolle; bei einer Begrenzung von aussen her von einer extrinsischen Kontrolle.

Andere Regulationsmechanismen

Mehrere Operons werden durch Attnuation geregelt. Die Attenuation beeinflusst die Fähigkeit der Polymerase über einen intrinsischen Terminator, den Attenuator am Beginn der Sequenz hinweg zu lesen.

Der Attenuator besteht aus einer Haarnadelstruktur, die sich auf ein äusseres Signal hin bildet. Der Mechanismus ist abhängig von der Translation der RNA durch das Ribosom. Ist diese bereits weiter fortgeschritten, beendet dies die Transkription.

Ein solcher Attenuationsmechanismus verstärkt die Wirkung des Tryptophanrepressors, indem es in Anhängigkeit von der Tryptophankonzentration die Transkription unterbricht. Hier ist der Mechanismus sehr wahrscheinlich so, dass die Ribosomen, die die RNA der Leader-Sequenz translatieren bei einem Tryptophanmangel inne halten und so die Transkription erlauben und sie andondten unterbinden.

In einigen Fällen findet man auch Regulationsmechanismen, die nicht auf Proteinen, sondern auf RNA beruhen. Für die Wirkungsweise ist ein allosterischer Mechanismus ebenso denkbar wie eine direkte Interaktion mit der Zielsequenz. In der Praxis findet man allerdings keine allosterischen Effekte, sondern nur eine direkte Interaktion durch Antisense-RNA, die dann entweder die Bindungsstelle der Ribosomen blockiert, die Stabilität beeinflusst, da sie einen Doppelstrang als Signal für Exonukleasen bildet oder sie bildet eine Art Terminationssignal, das die Transkription vorzeitig beendet.

Einen ungewöhnlichen Mechanismus findet man bei dem Phagen T7. Ein polycistronisches Gen wird in eine RNA umgschrieben, die Anschliessend durch die RNase III in mehrere RNAs der einzelnen Proteine gespalten wird. Das Schittsignal für diese RNase ist eine von der RNA ausgebildete Doppel-Helixstruktur.

Bei Säugern findet man ein ähnliches Prozessing bei den ribosomalen Untereinheiten. Die 45S-Untereinheit enhält die 18S, die 5,8S und die 28S-Untereinheit und ist stark methyliert. Sehr wahrscheinlich markieren die Methylgruppen die Bereiche, die später zur RNA werden.

Die rRNAs der Bakterien werden auf einem ähnlichen Weg aus einer Vorläufer-RNA durch RNase III freigesetzt.

Kontrolle der Transkription bei Eukaryonten

Im Zellkern der Eukaryonten sind drei Polymerasen für die Transkription verantworlich: Die Polymerase I transkribiert die rRNA, die Polymerase II die mRNA und die Polymerase III die tRNA und andere kleine RNAs.

Bei allen Transkriptionen spielen Faktoren, die an die DNA binden eine wichtige Rolle. Bei der Polymerase II arbeiten drei Hauptgruppen an der Initiation der Transktiption:

Allgemeine Transkriptionsfaktoren sind das Grundgerüst für die Transkription, bilden mit der RNA-Polymerase einen Komplex und sind für jede Transkription notwendig.
upstream-Faktoren binden stromaufwärts an die DNA, wobei sie an jedem Promotor binden und nicht reguliert werden.
Induzierbare Faktoren binden an Response-Elemente auf ähnliche Art wie die upstream-Faktoren, nur dass diese Gruppe reguliert wird.

Ein Abschnitt der DNA, der auf die Transkription einwirkt, sich aber in einiger Entfernung von dem Promotor befindet, wird Enhancer genannt.

Im Allgemeinen ist die Regulation bei den Eukaryonten positive; eine Repression findet man selten.

Die Polymerase I ist im Nucleolus loakalisiert; die anderen beiden im Nucleoplasma. Um die drei Polymerasen zu unterscheiden kann man ihre unterschiedliche Empfindlichkeit gegenüber $\alpha$ -Amanitin ausnutzen. Die Polymerase II reagiert darauf sehr empfindlich; die POlymerase I gar nicht und die Reaktion der Polymerase III schwankt zwischen den Spezies.

Die Polymerasen sind alle aus mehreren Untereinheiten aufgebaut. Bei der Polymerase II der Hefe fand man 10 oder 11 Untereinheiten. Ein wichtiges Merkmal der Polymerase II ist eine Ansammlung von kurzen repeats am C-Terminus. Werden diese deletiert, ist dies meist lethal.

Die RNA-Polymerase ähnelt der der Bakterien.

Die Untersuchungen stützen sich auf Versuche mit Xenopus-Oocyten, Transfektionssysteme, Transgene Systeme und in vitro-Systeme. Auf diese Weise versucht man, einen Promotor zu charakterisieren, indem man die DNA verändert und dann in dem Testsytem untersucht. Durch sukzessives Abschneiden eine Endes kreist man die Promotor-Sequenz immer weiter ein. Hat man die Grenzen eines Promotors ermittelt, versucht man durch Punktmutationen die relevanten Basen zu identifizieren. Entweder lässt sich - wenn das entsprechende Protein an mehrere Sequenzen bindet - eine Consensussequenz ermitteln oder man analysiert die Bindung eines Proteins durch Footprinting.

Polymerase I

Bei der Polymerase I findet man nur einen einzigen Typ von Promotor, der die Transkription der rRNA steuert, aus der hinterher die einzelnen rRNAs - mit Ausnahme der 5S-rRNA, die von der Polymerase II transkribiert wird - gespleisst werden.

Der Core-Promotor liegt im Bereich von -45 bis +20 und wird durch ein upstram control element bei -180 bis -107 verstärkt. Die beiden Sequenzen stimmen in weiten Teilen miteinander überein. Dort steuern zwei Hilfsproteine die Transkription. UBF bindet spezifisch an die beiden Sequenzen. Durch eine Bindung kann auch SL1 binden und an diesen Komplex lagert sich dann die Polymerase I an. SL1 ist für die sequenzspezifische Erkennung notwendig.

Polymrease III

Die Promotoren der 5S-rRNA und der tRNA befinden sich stromabwärts innerhalb der Sequenz, während z.B. die snRNA ihren Regulator stromaufwärts besitzt.

Bei der 5S-rRNA befindet sich der Promotor zwischen +55 und +80. Die Wirkung der internen Promotoren beruht darauf, dass zunächst sogenannte assembly Faktoren an die DNA binden, wobei einer in der Region des Promotors, der andere in Richtung des Startpunktes bindet. An den letzteren kann dann wiederum der eigentliche Initationsfaktor binden, der mit der Polymerase interagiert und so die Transkription initiiert.

Bei den stromaufwärts gelegenen Promotoren sind den Promotoren der Polymerase II sehr ähnlich und kann an dem upstream des Starts gelegenen TATA-Element geschehen, wird allerdings durch die weiter upstream liegenden Sequenzen PSE und OCT beeinflusst. An dem TATA-Element binden Proteine, die die RNA-Polymerase III an den richtigen Startpunkt bringen.

Bei allen an der Polymerase III wirksamen Faktoren findet man einen Präinitiationskomplex, d.h. die Faktoren binden vor der Polymerase und vermitteln so deren Bindung.

Polymerase II

Die Polymerase II ist in jedem Fall auf Hilfsfaktoren angewiesen und kann die Transkription alleine nicht initiieren.

Die dazu benötigten Faktoren werden als TFII bezeichnet. Die Startsequenz selber ist meist ein CA, das von Pyrimidienen flankiert ist: Py₂CAPy₅. Dieser Bereich wird Initiator genannt.

Der Promor selbst liegt meist in der Form einer TATA-Box vor.und liegt 25 bp upstream. Sie ist AT-reich und ähnelt der -10-Sequenz der Bakterien. Nur wenige TATA-lose Promotoren besitzen keine TATA-Box. Die TATA-Sequenz wird durch das TATA-binde-Protein TBP erkannt. es bindet zusammen mit unterschiedlichen TBP-assoziierten Faktoren an die DNA. Dieses TBP findet sich bei allen drei Polymerasen wieder, ist jedoch mit unterschiedlichen Faktoren assoziiert und wirkt deshalb unterschiedlich. TBP bindet die kleine Furche der DNA und vermittelt den Kontakt und die Bindung der Polymerase. Dadruch dass TBP die DNA um ca. 80 ,,knickt`` können die Polymerase und die TFIIs besser binden.

Für die eigentliche Initiation reicht das TBP jedoch nicht ausM es ist vielmehr notwendig, dass TFIIs in geordneter Reihenfolge nacheinander an den Komplex binden. Da auch stronabwärts Faktoren binden, kann die Transkription noch nicht beginnen. Erst nach dem der C-Terminale Teil der Polymerase phosphoryliert wurde, kann sie sich von den TFIIs lösen und beginnt die Transkription.

Bei den TATA-losen Promotoren ist der verlauf ähnlich, nur dient hier der Initiator als Positionierungselement.

Da die meisten Fakrtoren aus mehreren Untereinheiten bestehen, wirken etwa 20 Polypeptide an der Transkription mit. Die Funktion dieser Faktoren ist dem Sigma-Faktor der Bakterien analog.

Neben der TATA-Box liegen weitere upstream gelegene Faktoren eine entscheidende Rolle für die Initiation der Transkription. Diese binden induzierbare Faktoren. Zwar ist die TATA-Box für den Beginn der Transkription an einer bestimmten Stelle wichtig, allerdings sind die upstream geglegenen Element wichtiger für die Initiierung der Transkription.

Bei -75 findet man die CAAT-Box und bei -90 die GC-Box, die beide einen grossen Einfluss auf den Initiatinsprozess haben. Keines der verschiedenen Elemente ist unbedingt erforderlich; alle Elemente trangen zur Promotorfunktion bei, können sich aber auch gegenseitig ersetzen.

Beide Sequenzen werden von upstream-Faktoren erkannt, die - im Gegensatz zu den induzierbaren Faktoren - konstitutiv vorhandne sind. Man kann zeigen, dass der gesamte upstream-Bereich von Faktoren bedeckt ist, interagieren miteinander und erreichen so eine sehr hohe Flexibilität, die sich darin bemerkbar macht, dass man unterschiedliche Promotor-Sequenzen nahezu beliebig mischen kann. Es können unterschiedliche Proteine an diese Sequenzen binden und somit ist die Expression stark vom Kontext abhängig.

Bei der Untersuchung in vitro gilt zu beachten, dass die DNA hier - im Gegensatz zum Zellkern - nicht verpackt ist und somit auch die Bindungsmuster der Proteine unterschiedlich sein können. Es kann sein, dass ein Protein an den Promotor binde, diesen allerdings nicht aktiviert. so kann das Promotorelement gleichzeitig ein Aktivator und ein Repressor sein.

Reparatur und Transkription

Im Allgemeinen werden die transkribierten Gene bevorzugt repariert. Wenn die Polymerase auf eine defekte Stelle des Matritzenstrangs trifft, hält sie an und ermöglicht so einem anderen Protein, an sie zu binden. Dieses Protein verdrängt dann die Polymerase und leitet die Excisionsreparatur ein.

Enhancer

Die Position des Enhancers zum Promotor ist nicht festgelegt und er kann in beiden Orientierung wirken. Ein Enhancer kann jeden Promotor in seinem Einflussbereich stimulieren, wobei er up- wie downstream wirken kann.

Die Enhancer liegen meist in einer wenig gepackten Form vor und weisen viele Proteinbindungsstellen auf. Häufig findet man Tandem-Wiederholungen und auch innerhalb eine Enhancers findet man häufig Sequenzen mit einer unterschiedlichen Sequenz aber einer identischen Funktion. So wird der Enhancer erst inaktiviert, wenn weite Bereiche der Sequenz mutiert sind.

Teilweise beeinflussen die Enhancer die Transkription, in einigen Fällen sind sie sogar deren Auslöser.

Man kann zeigen, dass die Eigenschaften des Enhancers auf der räumlichen Nähe beruhen (lineare DNA mit einem Promotor am einen und einem Enhancer am anderen Ende wird verstärkt transkribiert, wenn man die Enden über eine Proteinbrücke verbindet). Man nimmt an, dass die zwischen Promotor und Enhancer liegende Struktur eine Schlaufe bildet und der Enhancer so - auf noch unklare Weise - seine Wirkung entfalten kann.

Man konnte bei GAL4 zeigen, dass die Transkriptionsfaktoren für die Bindung an die DNA und die Aktivation der Transkription unterschiedliche Domänen besitzen. Die DNA-bindende Domäne hat dabei in erster Linie die Aufgabe, die Aktivatorregion räumlich in die Nähe des Promotors zu bringen.

Diese Transkriptionsfaktoren beeinflussen die Transkription über eine Interaktion mit dem basalsen Appparat (Pol-II und TFII). Dabei kommt es bei einige Proteinen zu einem direkten Kontakt zwischen der Aktivatorregion und dem Transkriptionskomplex, in anderen Fällen wird die Interaktion über Cofaktoren vermittelt. Viele upstream- und Enhancer-Faktoren bestimmen auf diese Weise die Geschwindigkeit des Zusammenbaus des basalen Komplexes.

Repressoren können diese Interaktion durch ihre eigene Bindung unterdrücken.

Regulation der Transkription bei Eukaryonten

Die Transkription eines Gens kann auf folgenden Ebenen reguliert werden:

Aktivierung des Gens
Initiation der Transkription
Prozessing des Transkriptes
Transport ins Cytoplasma
Translation der mRNA

Die meisten regulatorischen Proteine setzen an der Transkription an.

Wenn eine Gruppe von Genen gemeinsam kontrolliert wird, findet man bei allen Mitgliedern ein Response-Elemten, eine identische Promotorstruktur, die mit einem bestimmten TF interagiert. Ein beispiel für die Kontrolle einer Gengruppe durch einen Faktor stellt die Hitzeschockantwort der Zelle da. Bei den Eukaryonten befindet sich der dafür zuständige Bindebereich ausserhalb der Promotorregion und wirkt als ,,alternativer`` Promotor für Proteine, die teilweise auf unterschiedliche ARten durch verschiedene Proteine kontrolliert werden.

Man findet bei den Eukaryonten häufig Mechanismen, bei denen unterschiedliche Sequenzelemente voneinander unabhängig dazu in der Lage sind, das zugehöroge Gen zu aktivieren.

DNA-bindende Motive

Die Interaktion der DNA geschieht über unterschiedliche DNA-bindende Motive:

Steroidrezeptoren
Zinkfinger-Motiv
Helix-Turn-Helix-Motiv
Helix-Loop-Helix-Motiv
Leucin-Zipper-Motiv

Die DNA-bindenden Motive sind vor allem in den induzierbaren TF zu finden, die nur in bestimmten Zellen synthetisiert werden und in ihrer Aktivität moduliert werden können.

Beim Zinkfinger interagiert eine Gruppe von Aminosäuren mit einerm Zinkion. Dieses Motiv ist das Hauptmotiv der Steroidrezeptoren.

Durch die Interaktion mit dem Zink bilden die AS bei dem Cys₂-His₂-Finger einen ,, Finger`` aus, der mit seinem C-Terminus eine $\alpha$ -Helix ausbildet, die zwei sequenzspezifische Kontakte mit der DNA eingeht. Diese Struktur bildet sich drei Mal aus. Zusammen passen die drei Finger in eine grosse Furche.

Bei dem Cys₂-Cys₂-Finger hingegen findet man häufig nur eienn Finger.

Bei Glucocoricoid- und Estrogen-Rezeptoren findet man zwei Finger, die $\alpha$ -Helices ausbilden, die über $\beta$ -Faltblätter zu einer hydrophoben Struktur verbunden sind. Diese Rezeptoren dimerisiern und bedecken hintereinander zwei Windungen der grossen Furche.

Die Steroidhormone wirken in der Zelle über die Bindung an einen spezifischen Rezeptor. Das Molekül diffundiert in die Zelle und bindet dort an seinen Rezeptor. Dadurch wird dann der Rezeptor, wie etwa der Glucocoricoid-Rezeptoren dazu befähigt, eine bestimmte Consensussequenz zu erkennen und aktiv zu werden.

Die so erkannten Responseelemente folgen einem bestimmten Consensus, bestehend aus zwei Halbelementen, da der Rezeptor, wie oben erwähnt, als Dimer bindet. Man bezeichnet diesen Protess als eine ligandenabhängige Transkription. Bei Homodimere liegen diese Kopf-an-Kopf und erkennen palindromische Sequenzen, während bei Heterodimere die Dimerisierung Kopf-an-Schwanz erfolgt.

Die Homöobox ist eine DNA-Sequenz von 60 AS länge, die in bestimmten Proteinen der meisten Eukaryonten auftritt. Sie wurde zuerst bei den für die Entwicklung von Drosophila verantwortlichen Genen entdeckt. Sie sorgen bei diesen Proteinen für die spezifische Erkennung der DNA. Sie befindet sich zumeist am C-Terminus und weist eine hohe Homologie zu den Sequnenzen bei prokaryontischen Repressoren auf.

Eine Dimerisierung kann von speziellen Domänen wie bei den Steroidrezeptoren oder von dem DNA-bindenden Motiv selbst wie bei dem HTH-Motiv vermittelt werden. In den meisten HLH-Motiven findet man in der Nachbarschaft eine basische Region, die für die DNA-Bindung notwendig ist und deshalb wird das Protein auch als bHLH bezeichnet. Man teilt die bHLH-Proteine in eine Klasse A die ubiquitär exprimiert wird und eine Klasse B die gewebespezifisch exprimiert wird, ein. Letztere sind als Heterodimere besonders aktiv; bei den ersteren vermutet man eine Homodimerisierung, ist sich aber über die genaue Struktur nicht klar.

Die Regulation kann bei diesen Proteinen über einer Veränderung der Dimerisierungs- oder der Bindungseigenschaften geschehen. So können manche HLH-Proteine auch im Prozess der Dimerisierung als Supressoren wirken, indem sie funktionsunfähige Dimere bilden. Durch die unterschiedliche Dimerisierung kann eine geringe Anzahl an Proteinen eine grosse Variabilität hervorbringen.

Ein ebenfalls dimerisierendes Motiv ist das Leucin-Zipper-Motiv. Es enthält einen Abschnitt mit Leucinresten, die das Motiv für die Dimerisierung bereitstellen. Die Leucinreste ragen aus einer amphipathischen Helix heraus und verzahnen sich miteinander vergleichbar einen Reissverschluss. Durch die Dimerisierung werden die DNA-bindenden Region der beiden Untereinheiten zueinander gebracht und können so mit der DNA interagieren.

Durch den Reissverschluss entsteht eine Y-förmige Konformation, bZIP-Motiv genannt. Die beiden Arme des Y sind die basischen DNA-bindenden Sequenzen, die so mit der DNA interagieren können.

Genregulation durch das Chromatin

In vivo stellt sich die Frage, wie die Transkriptionsfaktoren Zugang zu der dicht gepackten DNA erhalten. Ein Gleichgewichtsmodell bei dem die TF mit den Histonen um Bindungsstellen konkurrieren würde die stabile Transkription in der S-Phase, in der eine grosse Menge an Histonen existiert, nicht erklären.

Das Okkupationsmodell besagt, dass die Proteinklasse, die sich zuerst an die DNA anlagert von der anderen nicht mehr verdrängt werden kann. In vitro-Experimente scheinen dieses Modell zu bestätigen. Dies bedeutet, dass der Faktor schon bei der Replikation präsent sein muss, damit die Bindung der Nukleosomen verhindert wird. Ansonsten ist die DNA dauerhaft blockiert.

In neuerer Zeit hat man herausgefunden, dass die Histone von der DNA durchaus unter ATP-Verbrauch verdrängt werden können. Dieses dynamische Modell sieht vor, dass ein TF sich an die DNA anlagert, unter ATP-verbrauch die Nukleosomen verschiebt und so eine Nuklease-hypersensitive Region schafft.

Bei einigen TF hat man auch nachgewiesen, dass sie sich an die DNA an der Oberfläche der Nukleosomen anlagern können. Es gibt sogar Strukturen, bei denen die Wechselwirkung zwischen dem TF und dem Chromatin notwendig ist, damit die Transkription startet.

Regulation durch Abschirmung von Domänen

Da die Transkription von menschlichen Genen in der Maus deulich unterhalb des natürlichen Niveaus liegt, kam man zu dem Schluss, dass die Regulation neben Enhancer und Promotor auf weiteren Funktionen aufbauen muss.

Diese Stellen sind DNase-I-hypersensitiv und befinden sich am Ende des Clusters. An der 5'-Seite findet man beim $\beta$ -Globin z.B. eine hypersensitive locus control region LCR; ob der hypersensitiven 3'-Region eine Funktion zukommt ist ungewiss. Eine ähnliche Region findet man bei den $\alpha$ -Globinen und man vermutet, dass diese Region dazu dient, die DNA zu öffnen. Bei anderen Genen konnte man diese Sequenz nicht finden.

In vielen Bereichen findet man Isolatoren, die dazu dienen, Gene von den Einflüssen der Nachbarn zu isolieren. Platziert man einen Isolator zwischen einem Enhancer und einem Promotor, kann zwischen diesen keine Wechselwirkung mehr stattfinden.

Bei der Analyse von hsp70 in Drosophila fand man eine Sequnenz scs, die jegliche regulatorische Wirkung von einer Region auf die nächste verhindert. Diese findet man vor allem in den Interbanden, was dafür spricht, dass die Querbanden der Chromosomen funktionelle Einheiten darstellen, die durch die Interbanden getrennt sind. Diese Wirkung ist von der Orientierung unabhängig; er unterdrückt allerding immer den Enhancer, der in der von ihm aus abgewandten Seite des Promotors liegt. Die Funktionsweise dieses Elements ist noch nicht geklärt.

Zwischen LCR und Isolator kann eine matric attachment site MAR liegen, die die Domäne an der Kernperipherie verankert.

Methylierung

Bei den Eukaryonten spielt die Methylierung der DNA eine wichtige Rolle bei der Transkription. In einigen Geweben wird die Aktivität der Transkription durch eine Methylierung der Gene verhindert. Ein Gen, das aktiv ist, weil es nicht methyliert ist, bezeichnet man als untermethyliert.

Man stellt sich vor, dass die TF entweder erst nach dessen Demethylierung an den Promotor binden oder aber sich durch die Demethylierung eine Strukturveränderung ergibt, die die Initiierung der Transkription erst ermöglicht.

Bei manchen Genen findet eine Methylierung auch dann statt, wenn die Gene stark methyliert sind.

In manchen 5'-Regionen findet man CpG-reiche Inseln, die mit der Wirkung der Methylierung direkt verknüpft sind. Diese Inseln sind normalerweise unmethyliert und finden sich bei allen Haushaltsgenen, sowie bei den Promotoren von gewebeabhängig exprimierten Genen. Ausserhalb dieser Regionen findet man sie selten. Die CpG-reichen Inseln deuten demnach darauf hin, dass das Gen potentiell aktiv ist; reichen allerdings als Transkriptionssignal nicht aus. Die Methylierung der CpG-Region unterdrückt normalerweise die Transkription des entsprechenden Gens. Dies beruht sehr wahrscheinlich auf der Bindung eines Proteins, MeCP-1 an die methylierten Basen.

Die methylierten Stellen kann man in konstante und variable Regionen einteilen. Die zuerst genannten werden in allen Geweben methyliert; letztere liegen in den Geweben, in denen eine Expression stattfindet demethyliert vor. Im Sperma sind sowohl die konstanten als auch die variablen Bereiche methyliert und man vermutet, dass das Fehlen einer Methylierung auf deren Verlust zurückzuführen ist. Ob es eine Neumethylierung von nicht exprimierten Genen gibt ist ungewiss.

Man nimmt an, dass die Methylierung weiter gegeben wird, indem die Methylase an dem hemimethylierten Material aktiv wird und den nach der Replikation nicht methylierten Strang methyliert.

Auf diese Weise kann auch in der Keimzelle ein spezifisches Muster von Methylgruppen angebracht sein, das als genetisches imprinting weiter gegeben wird. So hängt bei Mäuseembryos die Expression einiger Gene von dem Geschlecht des Elternteils von dem sie stammen ab. Dieses Muster wird während der Gametogenese geprägt und wird das gesamte Leben über beibehalten. Einzig in den Urkeimzellen des neuen Tieres findet eine Veränderung des Musters de novo statt.

Verlauf der Translation Inhalt Transkription und Translation Spleissen der RNA