Unterabschnitte
Spleissen der RNA
Die DNA im Kern, die hnRNA (herterogenous nuclear RNA), manchmal auch
als prä-mRNA bezeichnet weist ein von der mRNA abweichendes Muster
auf. Die hnRNA ist im Kern an Proteine gebunden und liegt in Form der
hnRNP-Partikel vor. Die funktionelle Bedeutung dieser Partikel ist
noch weitgehend unklar.
Vergleicht man die mRNA mit der hnRNA, so kann man auf letzterer die
Spleissstellen lokalisieren. Die Grenzen eines Introns lauten immer
GT...AG. Dies bezeichnet man auch als GT-AG-Regel. Es kann prinzipiell
jede 3'- mit jeder 5'-Spleissstelle verknüpft werden.
Man hat herausgefunden, dass die Spleisstellen universell und nicht
gewebespezifisch sind. So kann auch ausgeschlossen werden, dass das
Spleissen auf einer Interaktion der RNA zurückzuführen ist.
Prinzipiell können alle Spleissstellen miteinander reagieren; in der
Praxis findet man jedoch nur sehr weniger Spleissvarianten und zumeist
sogar nur eine mRNA. Bei einem Versuch mit einer Ovomucoid-Sonde mit
sechs Introns ergab sich, dass die Introns bevorzugt in der
Reihenfolge 5/6, 7/4, 2 und 3/1 aus der reigenfen RNA
verschwinden. Daraus lässt sich folgern, dass die RNA durch ihre
Struktur die Zugänglichkeit der Spleissstellen zu modifizieren
scheint. In jedem Fall verläuft das Spleissen nicht in der Reihenfolge
in der die Introns auf dem Gen angeordnet sind. Die Erkennung der
zusammengehörigen Spleisstellen ist ein immer noch unverstandener
Mechanismus.
Beim Spleissvorgang erfolgt in einem ersten Schritt ein Snitt an der
5'-Spleissstelle. Das linke Exon liegt nun in einer linearen Struktur
vor. Das rechte Exon bildet eine Lassostrutur, indem das neu
entstandene 5'-Ende über eine 5'-2'-Verbindung mit dem Intron
verknüpft wird. Die Zielbase wird brach site genannt.
In einem weiteren Schritt wird die 3'-Spleissstelle durchtrennt und
die freien Enden ligiert. Das freie Intron verliert seine
Lassostruktur und wird schnell abgebaut.
Die branch site markiert die 3'-Spleissstelle. Bei einigen Organismen
wie der Hefe ist sie hoch konserviert. Sie liegt 18 bis 40 Nukleotide
stromaufwärts der 3'-Spleissstelle. Bei höheren Eukaryonten ist die
Sequenz weniger konserviert und bei einer Deletion kann der Organismus
auch auf andere Bereiche ausweichen. Chemisch gesehen entspricht das
Spleissen einer Umesterung.
Bevor das eigentliche Spleissen geschieht, lagert sich das Spleissosom
an der RNA zusammen. Dieses besteht aus RNA und Proteinen. Die relativ
kleinen RNAs werden als small nuclear RNA snRNA, bzw. in einer mit
Proteinen assoziierten Form als snRNP bezeichnet.
Die am Spleissen beteiligen snRNPs werden als U1, U2, U3, U4/U6 und U5
bezeichnet.
Der Spleissvorgang lässt sich grob in zwei Phasen einteilen: In der
ersten Phase werden die Consensussequenzen erkannt und
zusammengeführt, in einem weiteren Schritt erfolgt das eigentliche
Spleissen.
Die U1-snRNA geht eine Basenpaarung mit der 5'-Spleissstelle
ein. Nachdem U1-snRNP an der 5'-Spleisstelle gebunden hat, bindet die
U2F-snRNP in der Nähe der brach site, so dass sich dann U2 mit einer
komplementären Sequenz an die branch site selbst anlagern kann. Durch
diese Bindung erfolgt ein Übergang in den Präspleisskomplex, an den
sich SR-Proteine (wichtige Spleissfaktoren) anlagern.
Der Komplex wird durch die Anlagerung des U4/U5/U6-Trimers
stabilisiert und bildet nun das Spleissosom. Nun löst sich U1, U5
wandert zum Intron und U6 bindet an der 5'-Spleisstelle.
Durch das ATP-verbrauchende Ablösen von U4 wird U6 aktiviert und durch
U5 wird das Exon an der brach site gebunden. Diese Bildung des Lariats
legt fest, welche 3'-Spleissregion verwendet wird. An der der branch
site downstream am nächsten liegenden Spleisstelle spaltet der Komplex
nach Bindung von U5 die RNA.
Neben der Kern-RNA gibt es noch zwei weitere Klassen von Introns, die
man vor allem in Bakterien und Organellen findet. Diese Introns haben
die Fähigkeit, sich zu einer charakteristischen Sekundärstruktur
zusammenzulagern. Sie haben die Fähigkeit, sich selbst ohne die
Mitwirkung eines Spleissosoms zu spleissen. Dazu ist - da es sich um
eine Umesterung ohne Energieverbrauch handelt - keine Energiezufuhr
von aussen notwendig.
Man nimmt an, dass die eurkaryontischen Introns des Zellkerns einen
Sequenzverlust aufweisen, der sie daran hindert, sich selbst zu
spleissen und dass dieser Sequenzverlust durch die snRNA ausgeglichen
werden muss.
Da das Spleissen normalerweise nur in cis-Richtung erfolgt, können nur
Exons auf einer RNA miteinander verspleisst werden. In vitro konnte
man durch das Einführen komplementärer Sequenzen auch ein
trans-Spleissen herbeiführen. In vivo findet man diesen Mechanismus
sehr selten, z.B. bei Flagellaten, bei denen immer die gleiche
Leader-Sequenz von einem anderen Transkript kommend an
unterschieldiche Proteine angehängt wird. Eine ähnliche Situation
findet man auch bei den Actingenen von C. elegans. Dort wird
unterschiedlichen Transkripten von Aktin ein gemeinsamer Leader
angefügt.
Die RNA, die das trans-Spleissen ermöglicht wird SL-RNA genannt.
In einigen Fällen ist es möglich, dass aus einem primären Transkript
mehrere mRNAs entstehen. Dies bezeichnet man als alternatives
Spleissen.
Man konnte aus SV40-Zellen, die ein T- und ein t-Antigen in
unterschiedlichen Mengen profuzieren einen alternativen Spleiss Faktor
ASF isolieren, der mit dem Spleissfaktor SF2 identisch ist. Eine hohe
Konzentration von SF2 bevorzugt die 5'-Spleissstelle, die der
3'-Spleissstelle am nächsten liegt. Diesem Effekt wird der Faktor S5
entgegen.
Das Alternative Spleissen kann aber auch darauf beruhen, dass
Spleisstellen reprimiert werden. So kann die Verwendung eines Exons
(Beispiel Troponin T bei der Maus) durch das Binden von Proteinen
verhindert werden.
Bei Drosophila wird das Geschecht durch alternatives Spleissen
determiniert.
Bei dem Spleissen der tRNA sind die Strangspaltung und die Ligation
zwei getrennt Prozesse. Man findet bei den tRNA keine
Consensussequenz, die von einem Spleissenzym erkannt werden
könnte. Das Spleissen beruht dort auf einer Sekundärstruktur - nicht
auf einer Sequenz.
Der erste Schritt ist das Aufbrechen der Phosphodiesterbindung,
während der zweite Schritt darin besteht, in einer ATP-abhängigen
Reaktion mittels der RNA-Ligase eine neue Bindung aufzubauen.
Nach dem Schneiden des Introns lagern sich die beiden tRNA-Hälften zu
einer tRNA-ähnlichen Struktur zusammen. Die Reste werden dann nochmals
modifiziert und durch die RNA-Ligase verbunden.
Bei der Transkription der rRNA durch die Polymerase I erfolgt die
Termination an einer Stelle ca. 1.000 Basen stromabwärts der
eigentlichen Terminationsstelle. Das überstehende 3'-Ende wird
hinterher von einem Hilfsfaktor abgespalten.
Die Termination der Polymerase III ähnelt der Reaktion der
bakteriellen Polymerase. Sie terminiert normalerweise mit dem zweiten
U aus einer Folge von vier Uridin-Resten innerhalb einer GC-reichen
Insel. Diese Reaktion wird ohne Hilfsfaktoren durchgeführt und ist von
ihrer Funktion her unverstanden.
Bei der Polymerase II hat man zwar ähnliche Sequenzen gefunden, ist
sich über deren Bedeutung allerdings noch nicht im klaren.
Die Polymerase transkribiert über dne Punkt hinaus, an dem später die
Poly-A-Sequenz angeheftet wird. In höheren Eukaryonten findet man die
Sequnez AAUAAA kurz vor der Stelle, an der später die Polyadenylierung
erfolgt.
Zunächst bindet eine Spezifitätsfaktor an diese RNA-Sequenz. Durch
Wechselwirkungen mit diese Protein lagern sich in der Folge eine
Endonuklease und eine poly-(A)-Polymerase an die RAN an. Nachdem die
Endonuklease ein 3'-Ende erzeugt hat beginnt die poly-(A)-Polymerase
diskuntinuierlich A-Nukleotide an das 3'-Ende anzuhängen. Nachdem sich
das Poly-A-bindenden Protein an den entstandenen Poly-A-Schwanz
angelagert hat, interagiert die Polymerase mit diesem und seztzt die
Polyadenylierung fort, bis sie nach 200 bp abbricht.
Manche RNAs, wie die der Histone, werden nicht polyadenyliert. Die
Polyadenylierung wird dort durch eine Haarnadelstrukur verhindert.
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